检测人体细胞中不需要的DNA断裂的新方法

化脓性链球菌的CRISPR-Cas9基因编辑复合体。

哈佛医学院的研究人员开发了一种新方法，用于检测由流行的称为CRISPR-Cas RNA引导的核酸酶的基因编辑工具诱导的整个人类细胞基因组中不需要的DNA断裂。

最初描述人细胞中脱靶效应的同一团队的成员在《自然生物技术》上发表的一份报告中描述了他们的新平台，称为GUIDE-seq（通过测序评估的全基因组双链断裂的无偏识别）。

J. Keith Joung说：“ GUIDE-seq是第一种灵敏地检测由CRISPR-Cas核酸酶诱导的脱靶DNA断裂的全基因组方法，而并非以这些脱靶位点与靶位点相似为前提。” HMS大众病理学副教授，该论文的高级作者。“这种能力是以前不存在的，对于评估CRISPR-Cas RNA引导的核酸酶在临床上的任何使用都至关重要。”

CRISPR-Cas RNA引导的核酸酶用于切割DNA的双链以引入遗传变化，将一种称为Cas9的细菌基因切割酶与一个短RNA片段相结合，该片段与目标DNA序列相匹配并结合。在2013年Nature Biotechnology的一篇论文中，Joung和他的同事报告发现，CRISPR-Cas RNA引导的核酸酶还可以在与目标位点有显着差异的位点诱导双链断裂，包括多达五个核苷酸的错配。

作者指出，由于这种脱靶突变可能潜在地导致包括癌症在内的不利影响，因此识别并最终使不需要的双链断裂的能力降至最低，对于这些RNA指导的核酸酶在临床上的安全使用至关重要。

他们开发的方法涉及使用短的双链寡核苷酸，该寡核苷酸被细胞DNA中的双链断裂所吸收，充当因使用CRISPR-Cas引起的脱靶断裂的标记。这些标签允许对那些基因组区域进行鉴定和随后的测序，从而精确定位脱靶突变的位置。

GUIDE-seq的实验表明，它足够灵敏，可以检测出脱靶位点，在该位点，CRISPR RNA引导的核酸酶可诱导基因的不需要的突变，该突变在细胞群中的发生频率仅为0.1％。这些实验还表明，没有简单的规则可以预测脱靶双链断裂的数目或位置，因为许多此类突变发生在与靶位点完全不同的位点。

设计用来通过分析靶序列来预测脱靶突变的两种现有工具，在预测已证实的脱靶位点以及未被酶切过的错误鉴定的位点方面，其效率远低于GUIDE-seq。将GUIDE-seq与一种称为ChIP-seq的工具进行比较，该工具可识别蛋白质与DNA链的结合位点，证实了ChIP-seq不能提供一种可靠的方法来鉴定CRISPR-Cas诱导的双链断裂。

GUIDE-seq还能够识别未诱导表达CRISPR RNA指导的核酸酶的对照细胞系中的断点热点。

Joung指出：“以前有各种各样的论文描述了人类细胞中易碎的基因组位点，但是这种方法可能是第一个识别这些位点的方法，而无需添加增强此类断裂发生率的药物。我们也惊讶地发现，这些断裂主要发生在本研究中使用的两种细胞系的不同部位。捕获这些不依赖RNA的核酸酶的断裂的能力表明，GUIDE-seq可能是研究和监测活细胞中DNA修复的有用工具。”

此外，GUIDE-seq能够验证其通过缩短引导RNA片段来提高CRISPR-Cas准确性的方法减少了整个基因组中双链断裂的数量。Joung还期望GUIDE-seq在识别由其他基因编辑工具引起的脱靶突变时将很有用。

在追求这种可能性的同时，Joung指出了研究未改变而无法形成细胞系的人类细胞中脱靶突变的发生率和检测的重要性，这一过程将其转化为永生化的癌细胞。了解未转化细胞中脱靶突变的范围和数量将更好地了解CRISPR-Cas RNA引导的核酸酶和其他工具在临床应用中的功能。

Joung补充说：“ GUIDE-seq方法非常易于执行，我们打算在不久的将来向www.jounglab.org/guideseq上的非商业研究人员提供用于在线分析测序数据的软件。”

已经提交了涵盖GUIDE-seq技术的专利申请。

该研究的支持包括美国国立卫生研究院（NIH）主任先锋奖DP1 GM105378； NIH授予R01 GM088040，R01 AR063070和F32 GM105189;麻省总医院吉姆和安·奥尔研究学者奖；和国防高级研究计划局授予W911NF-11-2-0056。

出版物：Shengdar Q Tsai等人，“ GUIDE-seq通过CRISPR-Cas核酸酶实现脱靶切割的全基因组图谱分析”，《自然生物技术》（2014年）； doi：10.1038 / nbt.3117

图像：哈佛医学院； iStock